Laboratorio de Bacterias Gram Positivas, sus Fagos y Estrés
IQUIBICEN-CONICET Y Depto. de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires.
Directores: Sandra Ruzal-Mariana Piuri
Integrantes del Grupo
Dra. Mariana Piuri (Dirección de grupo) – Investigador Adjunto – Jefe Trabajos Prácticos QB
Lic. Eugenia Dieterle – Becaria Posgrado CONICET
Lic. Estefanía Urdániz – Becaria Posgrado CONICET
Msc. Liliana Rondon Salazar – Becaria Posgrado CONICET
Lic. Joaquina Fina Martín – Becaria Posgrado CONICET
Lic. Jordana Galizia – Becaria Posgrado CONICET
Lic. Pablo Waehner – Becario ANPCyT
Estudiante Luciano Proto Cassina – Becario Estímulo UBA

Contacto: sanruzal@gmail.com – marianapiuri@gmail.com
Teléfono: (011) 4576-3300 – Interno 294

Resumen
Desde 1990 el objetivo de nuestro grupo de investigación ha sido el estudio de los cambios adaptativos que sufren las bacterias al ser expuestas a estrés osmótico. Estos estudios nos han brindado experiencia en el conocimiento básico sobre las respuestas a estrés y respuestas de fase estacionaria, ambas importantes tanto del punto de vista básico, como también en procesos industriales donde se requieren biomasas importantes. Hemos considerado esencialmente aspectos de la fisiología y metabolismo, determinado los circuitos genéticos de respuesta a estrés, las relaciones entre varios efectores de estrés y los cambios tanto metabólicos como estructurales de las envolturas que resultan indispensables para el crecimiento en ambientes extremos. El desarrollo del tema nos ha conducido naturalmente a interesarnos por otros microorganismos y por las derivaciones de estos estudios en varios procesos biotecnológicos: la producción de bioinsecticidas por Bacilos entomopatógenos, la adaptación de Lactobacilos a condiciones de alta sal normalmente requeridas en la industria quesera y de chazinados, y presentes en el hospedador cuando las bacterias se emplean como alimentos funcionales en vista de su naturaleza probiótica. La aplicación de estos resultados deberían permitir obtener las cepas o procesos tecnológicos más eficientes para los procesos industriales específicos. (190 palabras)
En el año 2010, comenzamos a trabajar con bacteriófagos, explotando su capacidad de infectar con alta eficiencia y de manera específica a sus huéspedes para su empleo como herramientas en la manipulación genética de bacterias. En particular, intentamos dilucidar cómo se modifica la eficiencia de infección en función del estrés osmótico y reconocer cuáles son las moléculas que funcionan como receptores en las envolturas bacterianas. Por otro lado, llevamos adelante una línea de investigación en la que se utilizan bacteriófagos para diagnóstico y testeo de susceptibilidad a antibióticos en patógenos bacterianos. (92 palabras).
Tema 1- Conociendo el rol de las envolturas y la proteína S-layer de Lactobacillus
Nos proponemos elucidar la función de la proteína S-layer y su relación con los Ácidos Teicoicos polímeros asociados presentes en las envolturas de cepas Lactobacillus que poseen características probióticas. Las envolturas de Lactobacillus cumplen importantes funciones, en particular determinan la capacidad de interacción con el epitelio intestinal cuando se los emplea como probióticos. Nuestra intención en este proyecto es comprender como se organizan las envolturas, y como se adaptan a las condiciones de estrés ambiental que surgen tanto en la relación con el hospedador como en la elaboración de productos fermentados. Los efectores de estrés son esencialmente la alta concentración salina y alta acidez. Ya hemos demostrado que la alta sal produce profundos cambios en la estructura y composición de las envolturas. Se verificará cómo esas modificaciones influyen en cualidades probióticas como su capacidad de adhesión al epitelio intestinal, el efecto inmunomodulador de los ácidos teicoicos de L. casei y el efecto barrera contra patógenos bacterianos y virales de la proteína S-layer pura de L. acidophilus. Se busca validar su mecanismo de acción. Estas S-layers pueden ser incorporadas en interfaces líquidas o Films que darían marco a la posible aplicación de las proteínas S-layer en procesos de diagnóstico, preservación o profilaxis considerando su estabilidad y la propiedad de autoensamblado que le permite formar una estructura cristalina sobre distintos soportes.
Tema 2- Interacción de bacteriófagos y bacterias lácticas: Importancia de la estructura y composición de envolturas en la osmotolerancia ante la infección con bacteriófagos
Las bacterias acido lácticas (BAL) no sólo son relevantes en diversos procesos industriales sino que debido a su clasificación como organismos GRAS (generalmente reconocido como seguro) son excelentes candidatos para la expresión de antígenos y su posterior empleo como vacunas. Sin embargo para poder conservar la clasificación de GRAS es fundamental evitar la inclusión de ADN foráneo durante su manipulación genética. En este proyecto se explotará la capacidad de los bacteriófagos de infectar con alta eficiencia y de manera específica a sus huéspedes para su empleo como herramientas para la manipulación genética de bacterias lácticas. Buscaremos establecer qué moléculas de las envolturas funcionan como receptores para bacteriófagos y como se modifica la eficiencia de infección en función del estrés osmótico. La disponibilidad de la secuencia genómica de PL-1 y J1 permitirá la búsqueda de productos de genes involucrados en la interacción con el hospedador.
Tema 3- Empleo de bacteriófagos como herramientas genéticas y aplicaciones diagnsticas
Un tercio de la población mundial está infectada con Mycobacterium tuberculosis, la bacteria que causa tuberculosis (TB). Aproximadamente se detectan 9 millones de nuevos casos por año responsables de 2 millones de muertes. En Argentina ese número es cerca de 12000 casos anuales y 1000 muertes. Aunque la mayoría de los casos se resuelven con una terapia de al menos tres antibióticos durante 6-9 meses, la aparición de cepas MDR (multidrug resistant) y XDR (extensively drug resistant) ha complicado el panorama. La OMS ha incentivado la búsqueda de nuevas drogas que reduzcan el tiempo de tratamiento y la frecuencia de administración, menos tóxicas, de bajo costo y que el paciente no deba depender de una supervisión intensa. El screening de nuevas drogas empleando células enteras es probablemente la estrategia más adecuada ya que muchas veces la progresión de compuestos candidatos obtenidos en etapas tempranas usando otras técnicas resulta un proceso sin frutos. Aquí proponemos el uso de Mycobacteriofagos reporteros que acarrean genes fluorescentes. Luego de la infección pueden revelar el estado metabólico de la célula y por lo tanto su respuesta a antibióticos de manera simple y rápida (hs. vs. días) proponemos la creación de los que hemos denominado Fluoromycobacteriofagos de segunda generación. Para ello construiremos fagos mutantes de lisis independientes de la temperatura e incorporaremos nuevas variantes de proteinas fluorescentes con expresión optimizada en Mycobacterias. Proponemos también el agregado de TAGs en la cápside del fago para una simple y eficiente recuperación de los complejos fago-bacteria. Estas modificaciones darán mayor sensibilidad al ensayo y permitirán detectar de manera simple un pequeño numero de células en una muestra. Estas nuevas cualidades facilitarán la evaluacion de su empleo directamente en muestras de esputo de pacientes para la detección y TSA de manera rapida y precisa, objetivo principal de este proyecto

PUBLICACIONES
• Rapid whole cell assay of anti-tubercular drugs using second-generation fluoromycobacteriophages. Antimicrob Agents Chemother. (2016) pii: AAC03016-15. Urdániz E, Rondón L, Martí M, Hatfull G, Piuri M.
• Contribution of S-layer proteins to the mosquitocidal activity ofLysinibacillus sphaericus. PLOS ONE 2014 9(10)doi:10.1371/journal.pone.0111114
Allievi MC., Palomino MM, Prado Acosta M, Lanati L, Ruzal SM and Sánchez-Rivas C.
• Exposing the Secrets of Two Well-Known Lactobacillus caseiPhages, J-1 and PL-1, by Genomic and Structural Analysis. Appl Environ Microbiol. 2014 Nov 15;80(22):7107-21. Dieterle ME, Bowman C, Batthyany C, Lanzarotti E, Turjanski A, Hatfull G, Piuri M.
• Osmotic stress adaptation in Lactobacillus casei BL23 leads to structural changes in the cell wall polymer lipoteichoic acid. Microbiology (2013) 159: 2416-2426. Palomino MM, Allievi MC, Gründling A, Sanchez Rivas C, Ruzal SM.
• Complete Genome Sequences of Lactobacillus Phages J-1 and PL-1.Genome Announc. 2014 Jan 2;2(1). pii: e00998-13. doi: 10.1128/genomeA.00998-13. Dieterle ME, Jacobs-Sera D, Russell D, Hatfull G, Piuri M.
• Bioremediation Approaches in a Laboratory Activity for the Industrial Biotechnology and Applied Microbiology (IBAM) Course. Journal of Microbiology & Biology Education (2013) 14:131-134 Raiger Iustman L; Lopez NI; Ruzal SM.; Vullo D
• Generation of affinity-tagged fluoromycobacteriophages by mixed assembly of phage capsids . Appl Environ Microbiol. (2013);79(18):5608-15. Piuri M, Rondón L, Urdaniz E, Hatfull GF
• “A la Recherche” of functions for the spore protein SASP-E from Bacillus subtilis. Journal of Microbiology and Biotechnology (2013) 23:15-21. Ruzal SM, Bustos PL and Sanchez Rivas C.
• Application of BRED technology to construct recombinant D29 reporter phage expressing EGFP. FEMS Microbiol Lett. (2013) 344(2):166-72. da Silva JL, Piuri M, Broussard G, J Marinelli L, Bastos GM, Hirata RD, Hatfull GF, Hirata MH.
• S-layer proteins of Lactobacillus acidophilus inhibits JUNV infection. Biochemical and Biophysical Research Communications (2012)422: 590-595. María Guadalupe Martínez, Mariano Prado Acosta, Nélida A. Candurra, Sandra M. Ruzal.
• Recombineering: A powerful tool for modification of bacteriophage genomes” Bacteriophage; (2012), 2(1):1-10. Marinelli LJ, Hatfull GF and Piuri M. (Review),
• Metal Biosorption by Surface-layer proteins from Bacillus species. Journal of Microbiology and Biotechnology (2011) 21:147-153. Allievi MC, Sabbione F, Prado-Acosta M, Palomino MM, Ruzal SM and Sanchez Rivas C.
• Cluster K mycobacteriophages: Insights into the evolutionary origins of mycobacteriophage TM4. PLoS ONE; (2011), 6 (10): e26750. doi:10.1371/journal.pone.0026750. Pope WH, Ferreira CM, Jacobs-Sera D, Benjamin RC, Davis AJ, Dejong RJ, Elgin SC, Guilfoile FR, Forsyth MH, Harris AD, Harvey SE, Hughes LE, Hynes PM, Jackson AS, Jalal MD, Macmurray EA, Manley CM, McDonough MJ, Mosier JL, Osterbann LJ, Rabinowitz HS, Rhyan CN, Russell DA, Saha MS, Shaffer CD, Simon SE, Sims EF, Tovar IG, Weisser EG, Wertz JT, Weston-Hafer KA, Williamson KE, Zhang B, Cresawn SG, Jain P, Piuri M, Jacobs WR Jr, Hendrix RW, Hatfull GF.
• Evaluation of Fluoromycobacteriophages for detecting drug resistance in Mycobacterium tuberculosis . Journal of Clinical Microbiology; (2011), 49(5):1838-42. Rondón L, Piuri M, Jacobs WR Jr, de Waard J, Hatfull GF, Takiff H.
• New method for electroporation of Lactobacillus species grown in high salt. Journal of Microbiological Methods (2010) 83: 164-167. Palomino MM, Allievi MC, Prado-Acosta M, Sanchez Rivas C. and Ruzal SM
• Synergistic effects of the Lactobacillus acidophilus S-layer and nisin on bacterial growth. Applied and Environmental Microbiology (2010) 76:974–977. Prado-Acosta M, Ruzal SM, Allievi MC, Palomino MM and Sanchez Rivas C.
• Fluoromycobacteriophages for Rapid, Specific, and Sensitive Antibiotic Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis”. PLoS ONE; (2009), 4(3): e4870. doi:10.1371/journal.pone.0004870. Piuri M., Jacobs Jr. W.R. and Hatfull G.F.
• High salt stress in Bacillus subtilis: Involvement of PBP4* as a peptidoglycan hydrolase. Research in Microbiology (2009) 160:117-124 Palomino MM, Sanchez Rivas C and Ruzal SM .
• The S-layer of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 shows Murein Hydrolase Activity. Applied and Environmental Microbiology (2008) 74:7824–7. Prado-Acosta M, Palomino MM, Allievi MC, Sanchez Rivas C and Ruzal SM.
• BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes”. PLoS ONE;(2008), 3(12): e3957. doi:10.1371/journal.pone.0003957. Marinelli LJ, Piuri M, Swigonová Z, Balachandran A, Oldfield LM, van Kessel JC, Hatfull GF.
• Role of anionic phospholipids in the adaptation of Bacillus subtilis to high salinity.
Microbiology. (2006) 152:605-16. Lopez CS, Alice AF, Heras H, Rivas EA, Sanchez-Rivas C
• A peptidoglycan hydrolase motif within the mycobacteriophage TM4 tape measure protein promotes efficient infection of stationary phase cells. Molecular Microbiology, (2006), 62 (6): 1569-1585. Piuri M. and Hatfull G.F.
• Biosorption of copper by Paenibacillus polymyxa cells and their exopolysaccharide
World Journal of Microbiology and Biotechnology (2005) 21: 1157–1163
M. Prado Acosta, E. Valdman, S.G.F. Leite, F. Battaglini and S.M. Ruzal
• Cell-wall modifications during osmotic stress in Lactobacillus casei
Journal Applied Microbiology. (2005) 97: 84-95. Piuri M., C. Sanchez-Rivas and S.M. Ruzal
• Effect of Glutamate Synthase (Gogat) Activity In Bacillus subtilis Spore Properties.
Current Microbiology (2003) 47(3): 208-213. Sandra M. Ruzal and Carmen Sanchez-Rivas
• Role of the proteolytic system of Lactobacillus casei ATCC 393 in the adaptation to high osmolarity
Journal Applied Microbiology. (2003) 95:372-379
Piuri M., C. Sanchez-Rivas and S.M. Ruzal
• Phosphoenolpyruvate phosphotransferase system and N-acetyl glucosamine metabolism in Bacillus sphaericus Microbiology (2003); 149: 1687-1698 A.F. Alice, G. Pérez-Martinez & C. Sanchez-Rivas
• Existence of a true Phosphofructokinase in Bacillus sphaericus: cloning and sequencing of the pfk gene. Applied and Environmental Microbiology (2002)68:6410-6415 . Alejandro Alice, Gaspar Perez Martinez y Carmen Sánchez de Rivas
• Evaluation of an electrochemiluminescent method for the detection of microorganism resistance to ß-lactam antibiotics. Analytical Biochemistry (2001)290:379-82 . Priano G., Ruzal SM and F. Battaglini
• Characterization of Lactobacillus Carbohydrate Fermentation Activity using Immobilised Cell Technique . Biotechnology Progress, (2000) 16(1): 59-63
Cortón E, M. Piuri, F. Battaglini and S.M. Ruzal
• Biochemichal and biophysical studies of Bacillus subtilis envelopes under hyperosmotic stress. Internatinal Journal of Food Microbiology, (2000) 55: 137-142. C.S. Lopez, H.Heras, H.Garda, S.Ruzal, C. Sanchez-Rivas and E. Rivas
• Osmotic strength blocks sporulation at stage II by impeding activation of early sigma factors in Bacillus subtilis. Current Microbiology (1998);36(2): 75-79
S M. Ruzal, C. Lopez, E. Rivas and C. Sanchez-Rivas
• Role of DegU, in the osmotic stress response of Bacillus subtilis Current Microbiology. (1998);37: 368-372. Sandra M. Ruzal and Carmen Sanchez-Rivas
• A novel antimicrobial activity of a Paenibacillus polymyxa strain isolated from regional fermented sausages. Letters in Applied Microbiology (1998) 27: 9-13 Piuri M., C. Sanchez Rivas and Ruzal S.M.
• Variations of the envelope composition of Bacillus subtilis during growth in hyperosmotic medium. Current Microbiology (1998) 36 (1): 55-61 C. López, H. Heras, S. M. Ruzal, C. Sanchez-Rivas & E. Rivas.
• SASP (Small Acid Soluble Spore Proteins) and spore properties in Bacillus thuringiensis var. israelensis and Bacillus sphaericus . Current Microbiology. (1998) 36: 220-225. Adriana Cucchi & Carmen Sanchez de Rivas
• Normal induction of the SOS response in B.subtilis is prevented by the mutant repressor from phage phi105cts23. FEMS Letters. (1998) 167: 315-320 Clara P. Rubinstein, Alejandra Guerchicoff and Carmen Sanchez-Rivas
• DNA supercoiling and osmoresistance in Bacillus subtilis 168. Current Microbiology (1997) 35:309-315. Alice and C. Sanchez-Rivas
• Site specific recombiantion system from Tn1000 (gd) stabilises recombinant plasmids in Escherichia coli. Biotech.Letters. (1997) 19: 331-333.M. Bellani, C.Nudel y C.Sanchez-Rivas
• Tn1000 insertions stabilize pBR322-derived recombinant plasmids in Escherichia coli. Biotech.Letters. (1997) 19: 1-5. M. Bellani, V.Schlain, C.Nudel y C.Sanchez-Rivas.
• Survival of Bacillus megaterium strains in water Revista Soc. Arg.Microbiol (1996) 28:170-174. FMPalmada & C. Sanchez-Rivas
• ssp genes and spore osmotolerance in Bacillus thuringiensis israelensis and Bacillus sphaericus. Current Microbiology. (1995). 31(4):228-233 A.Cucchi and C.Sanchez-Rivas
• Osmoresistance of spores from Bacillus subtilis and the effect of ssp mutations.
Microbiology. (1994)140: 2173-2177. Ruzal SM, Alice A.& Sanchez-Rivas C.
• Physiological and genetic characterization of the osmotic stress response in Bacillus subtilis. Canadian Journal of Microbiology (1994) 40: 140-144
Ruzal SM and Sanchez-Rivas C.
• Anti-SOS effects induced in Bacillus subtilis by a phi105 mutant prophage.
Achieves in Microbiology. 160: 486-491(1993). Rubinstein C., Coso O., Ruzal S & Sanchez-Rivas C.
• The spoOA and degU genes of Bacillus subtilis show genetic homology.
FEMS Microbiol Lett (1993) 107:307-12. Cucchi A,& Sanchez-Rivas C.

SERVICIOS DE ASISTENCIA PROFESIONAL OFRECIDOS
• Curso de Capacitación en Identificación básica y cuantificación de microorganismos destinado a personal del área Microbiología de empresas. Entrenamiento de 30 hs.
• Caracterización taxonómica de cepas de Lactobacillus y Bacillus por patrón de fermentación de azucares y técnicas moleculares.
COLABORACIONES
• Dr. Graham Hatfull . Department of Biological Sciences and Pittsburgh Bacteriophage Institute, University of Pittsburgh, Pittsburgh, USA.
• Dr. Christian Cambillau. Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques, UMR 7257 Aix-Marseille Université, France.
• Dra. Rosario Durán Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo, Montevideo, Uruguay.
• Dr. Marcelo Martí. Bioinformática Estructural de Proteínas, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, IQUIBICEN-CONICET, Buenos Aires, Argentina
• Dr. Adrián Turjanski . Grupo interdisciplinario de Bioquímica Estructural Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, IQUIBICEN-CONICET, Buenos Aires, Argentina
• Dra. Verónica García. Regulación de la la respuesta inmune celular por proteínas de señalización
• Dra. Susana Poggi. Lab. Bacteriología de la TBC Dr. Abel Cetrangolo – Instituto de Tisioneumonología Dr. Raúl Vaccarezza, Hospital Muñiz, Buenos Aires, Argentina.